研究背景

通过细胞重编程过程从体细胞中获取诱导性多功能干细胞（iPSC）是生物医学研究中的一个里程碑式的发现，开发通过模拟天然生物化学信号和生物物理线索的功能性生物材料去影响多能干细胞行为是干细胞研究的一个活跃领域，其中，水凝胶是最具吸引力的生物材料之一。

【资料图】

研究成果

国家纳米科学中心、中国科学院大学聂广军研究团队报道了一种受细胞重编程启发的动态响应水凝胶，用于人和小鼠体细胞多能性的强力诱导（包括衰老细胞），细胞重编程响应水凝胶表现出动态生物响应性，以感知重编程过程中代谢重塑和细胞外细胞的酸化，它通过调节相应的力学性能进行响应。研究表明，在细胞重编程过程中，细胞重编程响应水凝胶机械性能的自主变化，在适当的时间引发相分离的YAP生物分子缩合物的形成，确保比传统的细胞重编程方法更快、更有效地产生iPSC。

此项研究工作以“Cell reprogramming-inspired dynamically responsive hydrogel boosts the induction of pluripotency via phase-separated biomolecular condensates”为题发表在国际顶级期刊《Advanced Materials》上。

图文速递

一、iPSC生成过程中的细胞骨架重排、代谢重塑和细胞外酸化

为制造受细胞重编程启发的动态响应水凝胶，增强体细胞的多能性诱导，首先评估iPSC生成过程中的主要变化。用罗丹明标记的鬼笔环肽检测放线细胞骨架在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和iPSC中的表达和分布模式，与MEFs的扩散形状相比，iPSC通常以紧密集落的形式出现，但肌动蛋白的表达较少，肌动蛋白集中在细胞核周围细胞质的紧密区域，细胞也没有表现出大量的应力纤维束（图2a）。MEFs具有可观察到的肌动蛋白蛋白表达，肌动蛋白在整个细胞体中扩散，细胞表现出大量的应力纤维束（图2a）。MEFs和iPSC提示在iPSC生成过程中细胞骨架重排。

为评估细胞重编程过程中糖酵解过程基因的表达模式，用OSKM转导MEFs，收集在不同时间点进行重编程的细胞。糖酵解过程基因（Hk2、Pgk1、Pkm、Ldha、Slc2a1和Eno1）的表达水平在细胞重编程过程中显著增加（图2b），此外，观察到在另一组转录因子介导的细胞重编程期间糖酵解过程基因的上调（图2c），包括OCT4，SOX2、KLF4和GLIS1，这证实了从体细胞氧化磷酸化到多能依赖性糖酵解状态的代谢转变是细胞重新编程过程中的普遍现象。

使用线粒体膜电位敏感染料（四甲基罗丹明甲酯，TMRM）对未编程的MEFs、iPSC和在不同时间点进行细胞重编程的细胞进行了活细胞成像。线粒体膜电位的变化反映在TMRM荧光强度的增加中（图2d）。经历细胞重编程的细胞的细胞外pH逐渐从碱性转变为酸性（图2e-f）。这些数据证实了细胞骨架重排、代谢重塑和细胞外酸化发生在iPSC的生成过程中。

二、受细胞重编程启发的动态响应水凝胶的制备及其参数优化

制造一种受细胞重编程启发的动态响应水凝胶，在细胞重编程过程中真实地感知上述变化，并通过相应地改变机械性能作出响应。为此，开发藻酸盐，通过改变钙离子的粘度和浓度来调节褐藻酸盐生物材料的机械性能（图3a-b），并制备具有蛋盒结构的3D水凝胶（SA-2.1、SA-2.2、SA-2.3、SA-2.4）。量化在可变硬度的3D水凝胶中进行重编程的细胞形成的细胞簇的生长速率。与较硬的水凝胶相比，较软的水凝胶（SA-2.4）中的细胞簇表现出更高的生长速率。

为更好地模拟细胞外基质的生物学特征，用纤连蛋白衍生的肽GGGGRGDSP对藻酸盐的侧链进行功能化，发现SA-2.4水凝胶的肽修饰版本导致细胞簇的膨胀率更高。用聚γ-谷氨酸（γ-PGA）进一步修饰GGGGRGDSP功能化的藻酸盐（SA-2.4-RL），GGGRGDSP/γ-PGA功能化海藻酸水凝胶被称为细胞重编程激发的动态响应水凝胶（图3c-d）。将第4天重编程的细胞包封到SA-2.4、SA-2.4-RL或细胞重编程响应性水凝胶中，发现细胞重编程响应水凝胶允许更好地扩展细胞簇（SA-2.4-RL-PL水凝胶的平均直径为10.1±2.5μm，SA-2.4-RL-PH水凝胶的平均径为10.5±1.9μm）（图3e-f）。此结果表明，细胞重编程响应水凝胶可以支持由经历重编程的细胞形成的细胞簇的扩增（图3e-f）。

利用细胞重编程响应水凝胶的可调性质发现当CaCl2溶液的浓度降至0.625%时，天然或修饰形式的藻酸盐可以稳定地转化为具有稳定蛋盒构型的3D水凝胶，浓度再低则不行。细胞重编程响应水凝胶（SA-2.5-LL-PL或SA-2.5-RL-PH）支持最高的细胞簇生长速率，平均直径在SA-2.5-RL-PL水凝胶中为11.5±1.0μm，在SA-2.5RL-PL水凝胶中为11.9±1.7μm（图3e-f），其中SA-2.5-RL-PL水凝胶实现了活细胞簇数与死细胞簇数的最高比率。SA-2.5-RL-PL表现出蛋盒构型（图4a）和多孔微观结构，如扫描电子显微镜所确定的（图4b）。 

三、细胞重编程响应水凝胶的多能性诱导

为研究细胞重编程响应水凝胶对多能性诱导的影响，通过慢病毒感染用Yamanaka因子转导MEFs，后加入多西环素（Dox）。将第4天重编程的细胞包封到重编程响应性水凝胶（SA-2.5-RL-PL组）、非响应性水凝胶中（SA-2.5组）或在有/没有喂食器的情况下接种的组织培养板上（TCP对照或TCP On Feeder组）（图4c），细胞自发聚集成球形簇（图4d）。

随着细胞重编程的进行，球形细胞簇的大小变得更大（图4d-e），伴随着代谢重塑和细胞外酸化（图2b-f）。通过流变仪测定，细胞重编程响应水凝胶（SA-2.5-RL-PL）的硬度增加（图4f-g）生/死细胞簇的钙黄绿素AM/PI双重染色（图4h）显示在细胞重编程响应水凝胶中，细胞簇是随机分散的，保持理想生长。用罗丹明标记的鬼笔肽进行了免疫染色分析，胞骨架蛋白肌动蛋白集中在细胞核周围细胞质的致密区域，没有表现出广泛的应力纤维束（图4i）。列举碱性磷酸酶阳性细胞簇的数量，发现从1×104转导的MEFs中，在重编程响应水凝胶中，第10天有519±25个碱性磷酸酶阳性的细胞簇，其大小相对较大（SA-2.5-RL-PL；图4j-k）。第18天，TCP对照组（78±7个菌落，来自1×104转导的MEFs）或TCP On Feeder组（330±19个菌落，源自1×104转染的MEF）（TCP对照或TCP On Feder；图4j-k）中没有明显的碱性磷酸酶阳性细胞簇。这些数据共同证明，与非响应性水凝胶或传统的重编程方法相比，细胞重编程响应性水凝胶以更快、更有效的方式促进细胞重编程。

为证实细胞重编程响应性水凝胶促进多能性的强大诱导，从细胞重编程反应性水凝胶原位释放的细胞簇中衍生出单克隆iPSC系（3D -响应- iPSC），表现出典型的圆顶状形态（图5a），碱性磷酸酶染色呈阳性（图5b）。多次传代后显示出正常的核型，表明3D -响应- iPSC的基因组稳定性（图第5c段）。评估3D -响应- iPSC自发分化为胚状体（EB）后谱系标志物的表达表明细胞重编程响应性水凝胶可以促进体细胞产生iPSC。 

四、细胞重编程响应水凝胶使衰老细胞更容易接受细胞重编程

将年轻细胞产生的3D-响应-iPSC与由衰老细胞产生的3D-响应-iPSC进行比较，表现出典型的圆顶状形态和碱性磷酸酶阳性染色，表达核心多能性相关因子OCT4和SOX2。内源性多能性相关基因的转录水平（Dax1、Esrrb、Oct4和Nanog）在3D-响应-iPSC（来源于衰老细胞）或3D-响应-iPSC（来源于年轻细胞）中的表达与ESCs中的表达相当。表明与非响应性水凝胶或传统的细胞重编程方法相比，细胞重编程响应性水凝胶以更快、更有效的方式促进衰老细胞的重编程。

五、细胞重编程响应水凝胶改善人体细胞产生的iPSC

从细胞重编程响应水凝胶原位释放的碱性磷酸酶阳性细胞簇中衍生出人iPSC（3D-响应-iPSC），在多次传代后显示出正常的核型，表明3D-响应-iPSC的基因组稳定性（图第6g段）。3D-响应-iPSC或hiPSCs中内源性Oct4和Nanog启动子区的甲基化模式与H9中的甲基化高度相似，表明内源性Oct4和Nanog的启动子区DNA完全去甲基化，分子重编程成功（图6o）。评估3D-响应-iPSC自发分化为胚状体（EB）后谱系标记物的表达表明3D-响应-iPSC向所有三个胚层的分化潜力（图6r）。证明细胞重编程响应水凝胶增强了人类iPSC的生成。

六、重编程响应水凝胶细胞内细胞重编程的稳健性和再现性

与非响应性水凝胶（1×104支持细胞中的65±6碱性磷酸酶阳性簇）或传统组织细胞相比，在细胞重编程响应性水凝胶中观察到更多更大尺寸的碱性磷酸酶阳性细胞簇（1×104支持细胞中131±9碱性磷酸酶阳性的细胞簇）板。此外，3D-响应-iPSC来源于从细胞重编程响应水凝胶原位释放的碱性磷酸酶阳性细胞簇。支持细胞衍生的3D-响应-iPSC表现出典型的圆顶状形态，碱性磷酸酶阳性染色，OCT4和SOX2。3D resp iPSC中内源性多能性相关基因的转录特征与ESCs相似。证明了细胞重编程响应水凝胶对不同类型的人和小鼠体细胞加速诱导多能性的稳健性和再现性。

七、细胞重编程过程中成功生成iPSC的细胞重编程响应水凝胶的时间窗要求

为理解细胞重编程响应水凝胶内的细胞重编程动力学，研究在细胞重编程响应水凝胶内成功产生iPSC系的时间窗要求。发现将经历重编程的细胞从组织培养板转移到重编程响应水凝胶的所有测试时间点都产生了自我更新的iPSC细胞系。重编程响应性水凝胶的降解产物不会干扰MEFs或经历重编程的细胞的生存能力，表明重编程响应型水凝胶具有良好的生物相容性和安全性。

八、细胞重编程响应水凝胶内多能性的强大诱导需要相分离的YAP生物分子缩合物

研究在细胞重编程响应水凝胶内强大诱导多能性的机制，发现体细胞基因或多能性相关基因的闭合或开放染色质动力学与各自基因表达的变化相关，表明这些染色质动力学是功能性变化（图7b-c）。在第12天，重编程响应性水凝胶主要显示YAP的核分布（图7d），细胞重编程响应水凝胶中相分离的YAP生物分子缩合物对体细胞强有力地重编程为iPSC具有功能性意义。

为证实细胞重编程响应水凝胶内内源性YAP点状物形成的观察结果，试图在其他细胞类型中重建相分离的YAP缩合物，在HEK293T细胞中表达了增强的绿色荧光蛋白标记的YAP（EGFP-YAP），EGFP-YAP显示出点状分布，这与EGFP对照组相反。在MEFs中进行了光漂白（FRAP）实验后的荧光恢复，并在光漂白后几秒钟内观察到EGFP-YAP点状荧光信号的恢复，证明了类液体缩合物的特征。

使用预测蛋白质内在无序区（IDRs）的算法对YAP蛋白的氨基酸序列进行进一步分析，结果表明YAP蛋白具有许多IDRs（图8a）。YAP蛋白具有进行相分离的能力。在细胞重编程过程中，细胞重编程响应性水凝胶的硬度随着代谢重塑和细胞外酸化而增加，细胞重编程响应水凝胶的硬化引发了相分离YAP生物分子缩合物的形成（图7d）。YAP的转录活性是在细胞重编程响应性水凝胶内稳健生成iPSC所需的。 

结论与展望

描述了一种动态的细胞重编程响应性水凝胶，不使用基质胶或饲养细胞的情况下实现了iPSC的稳健生成，从而实现了无动物iPS细胞的生成，真正实现与正在进行重编程的细胞的动态相互作用，揭示了细胞重编程响应水凝胶中细胞重编程的分子机制。

文献链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202211609.